Ig-seq 操作说明

数据下载

从 NCBI SRA 平台下载对应的 Ig seq 项目数据。

• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/

先导入 google cloud 的 bucket 中，然后通过 gsutils 下载到本地或 ibex 文件夹中。

MiXCR 数据分析

安装 MiXCR

conda install -c imperial-college-research-computing mixcr

Ig-seq 快速使用

# Align
Align: mixcr align–library my_library -t 8 -r align_log.txt R1 R2 alignments.vdjca -s hs
# What is the my_library used here

# Assemble
Assemble: mixcr assemble -r assemble_log.txt -OseparateByV = true -OseparateByJ = true -OseparateByC = true align-
ments.vdjca clones.clns

使用介绍

典型的 MiXCR 工作流程主要由三个部分构成：

• align：将测序结果比对到 T 细胞或 B 细胞受体的V、D、J、C基因参考序列上

• assemble：利用前一步骤获得的比对结果拼接 clonotypes（为了提取特定的基因区域信息，比如CDR3）

• export：输出比对结果（exportAlignments 模块）或者 clones 信息（exportClones 模块），生成可读文件

MiXCR 的 assemble 模块有几种不同的拼接方法可以选择：

• assembleContigs：拼接完整的 TCR 或者 IG 受体 clonotype 序列

• 对于RNA-Seq or non-targeted DNA data, 工作流程可能包括以下两部分：

  • assemblePartial：将有重叠区域的序列片段拼接成相对较长的包含 CDR3 区域的 contigs

  • extend: 估算测序和比对质量较好但长度较短的 TCR 比对序列的 germline 序列

为了简化输入命令，MiXCR提供了 analyze 命令模块，打包了整个分析流程

支持的数据类型：

fasta，fastq，fastq.gz，paired-end fastq和fastq.gz。作为每一步骤的输出结果，MiXCR 生成包含各种信息的二进制压缩文件（比对生成 alignments，拼接生成 clones）。利用exportAlignments 和 exportClones 命令模块，每一个二进制文件都可以转化成 tab 分割的可读文本文件。

默认流程 multiplex-PCR

利用 analyze amplicon 命令分析 multiplex-PCR 扩增的 TCR/BCR 基因 DNA 片段

>mixcr analyze amplicon --species hs --starting-material dna --5-end v-primers --3-end j-primers --adapters adapters-present --receptor-type IGH input_R1.fastq input_R2.fastq analysis

只有一个参数修改为非默认值（–receptor-type IGH），这个参数的改变可以让MiXCR 调用针对B细胞优化的比对模块并且只输出IGH序列。其实这个参数是可以缺省的，缺省状态下MiXCR会调用默认的比对模块并输出样本中所有的TCR/BCR序列。 生成的文件（analysis.clonotypes.IGH.txt）是一个 tab 分隔的表格，包含 CDR3 序列拼接的所有clonotypes（克隆丰度，CDR3序列， VDJ基因等）。

分步骤执行的命令：

# 1. Align 把原始序列比对到IGH基因的VDJ基因序列片段上
> mixcr align -s hs -p kAligner2 input_R1.fastq input_R2.fastq alignments.vdjca
# 2. Assemble 拼接 clonotypes
> mixcr assemble alignments.vdjca clones.clns
# 3. Export 将包含clones列表的二进制文件（analysis.clna）导出为可读的文本文件
> mixcr exportClones --chains IGH clones.clns clones.txt

基于 5’RACE 扩增实验的数据分析

考虑基于 5’RACE（一个 read 覆盖 CDR3 区域和临近序列，另一个 read 覆盖 V 基因的 5’UTR 和下游序列）实验准备的 IGH 基因 cDNA 文库双端测序的数据处理流程，全部分析流程可以通过analyze amplicon 命令实现:

> mixcr analyze amplicon --species hs --starting-material rna --5-end v-primers --3-end j-primers --adapters adapters-present input_R1.fastq input_R2.fastq analysis

结果文件（analysis.clonotypes..txt）包含详细的 clonotypes 信息。 分步骤执行的命令：

# 1. Align 把原始序列比对到IGH基因的VDJ基因序列片段上
> mixcr align -s hs -OvParameters.geneFeatureToAlign=VTranscript --report analysis.report input_R1.fastq input_R2.fastq analysis.vdjca
# 2. Assemble 拼接 clonotypes
> mixcr assemble --report analysis.report analysis.vdjca -a analysis.clna
# 3. Export 将包含clones列表的二进制文件（analysis.clna）导出为可读的文本文件
> mixcr exportClones --chains TRA analysis.clna analysis.clonotypes.TRA.txt
> mixcr exportClones --chains TRB analysis.clna analysis.clonotypes.TRB.txt

1. 用来比对 V 基因的非默认基因特征（-OvParameters.geneFeatureToAlign=VTranscript）同时利用了两个 reads 的信息，为了让 MiXCR 利用 CDR3 反向 read 比对V基因的 5’UTRS 和部分 5’端编码区域。MiXCR 还会生成 report 文件（通过可选参数 –report 指定），其中包含的具体运行统计信息。可以利用 exportAlignments 命令将比对生成的二进制结果（analysis.vdjca）转化为可读的文本文件。

2. 步骤会校正 PCR 和测序错误并建立 clonotypes，默认情况下 clonotypes 会拼接 CDR3 序列；可以通过设置 assemble 模块的参数来制定其他的基因区域（参考assemble documentation），可选的 report 文件 analysis.report 包含各种调试信息。

3. 导出的各种选项详见 export 文档，上述的所有步骤都可以根据特定研究的分析流程进行个性化设置。

高质量全长 IG 免疫组库分析

对于基于 cDNA 全长的 IG 免疫组库分析，我们一般推荐 UMI 标签制备文库并使用非对称双端测序 350 bp + 100 bp Illumina MiSeq测序方法（详情参考Nature Protocols paper）。这种方法可以获得长片段高质量测序结果，而且可以利用 MiGEC software 有效去除 PCR 和测序错误。获得的高质量数据可以进一步利用 MiXCR 处理，以提取全长 IGH 或 IGL 组库。

使用analyze amplicon命令分析:

> mixcr analyze amplicon --species hs --starting-material rna --5-end v-primers --3-end j-primers --adapters adapters-present --receptor-type BCR --region-of-interest VDJRegion --only-productive --align "-OreadsLayout=Collinear" --assemble "-OseparateByC=true" --assemble "-OqualityAggregationType=Average" --assemble "-OclusteringFilter.specificMutationProbability=1E-5" --assemble "-OmaxBadPointsPercent=0" input_R1.fastq input_R2.fastq analysis

这一步骤会生成以下结果文件（analysis.clonotypes.IGH.txt，analysis.clonotypes.IGK.txt 和analysis.clonotypes.IGL.txt），其中包括详细的 clonotypes 信息。这里我们要强调几个可选参数：

• –receptor-type BCR: 需要 MiXCR 调用 B 细胞优化的比对模块（等同于对 align 模块使用 -p kAligner2 参数）并且只输出 IG 序列。

• region-of-interest VDJRegion: 对 assemble 模块使用 -OassemblingFeatures=VDJRegion 参数

• –only-production 在 export 输出的 clonotypes 中过滤掉 out-of-frame 和 stop codon

• –align在 align 过程中设置其他的参数

• –assemble在 assemble 过程中设置其他参数

分步骤执行的命令：

# 1. 合并双端 reads 并比对 alignment：MiXCR 的 align 模块可以合并双端 reads 并比对到参考的 V/D/J 和 C 基因上，我们推荐使用 KAligner2 处理 IG 数据
> mixcr align -p kaligner2 -s hs -r alignmentReport.txt -OreadsLayout=Collinear -OvParameters.geneFeatureToAlign=VTranscript read_R1.fastq.gz read_R2.fastq.gz alignments.vdjca
# 2. Assemble拼接clones
> mixcr assemble -r assembleReport.txt -OassemblingFeatures=VDJRegion -OseparateByC=true -OqualityAggregationType=Average -OclusteringFilter.specificMutationProbability=1E-5 -OmaxBadPointsPercent=0 alignments.vdjca clones.clns
# 3. Export输出clones结果
> mixcr exportClones -c IGH -o -t clones.clns clones.txt

1. 选项 -s用来指定物种（e.g. homo sapiens - hsa, mus musculus - mmu），参数 -OreadsLayout 用来设定 reads 方向（Collinear, Opposite, Unknown）。这里需要注意的是，经过 MiGEC 分析的双端 reads 方向是 Collinear。除了 KAligner2，也可以使用默认的MiXCR 比对模块，只是也许会忽略一些亚变异类型，这些变异类型是由 V 基因片段的若干核苷酸插入形成的。

2. -OseparateByC=true 把 clones 按照不同的抗体亚型分类, -OcloneClusteringParameters=null 关闭基于频率的 PCR 错误校正。 根据数据质量，可以通过设置 -ObadQualityThreshold参数来调节输入数据的阈值来优化 clonotypes 的提取。

3. 选项 -o和 -t用于过滤包含 out-of-frame 和 stop codon 的 clonotypes，-c指定哪条链的数据应该被提取（e.g. IGH, IGL）。

RNA-Seq数据分析

MiXCR 可以用于提取 RNA-Seq 数据中 TCR 和 BCR 的 CDR3 组库，提取效率取决于样本红 T/B 细胞的丰度和测序长度。推荐 2x150bp 或者 2x100bp 的双端测序方法。不过在双端 2x50bp 的 RNA-Seq 数据（比如肿瘤样本中），主要 clonotypes 信息也可以被提取。

用 analyze shotgun 命令分析：

> mixcr analyze shotgun --species hs --starting-material rna --only-productive input_R1.fastq input_R2.fastq analysis

生成的结果文件（analysis.clonotypes.TRA.txt, analysis.clonotypes.IGH.txt 等）包含clonotypes 的详细信息。

分步骤操作流程：

# 1. Align 比对reads
> mixcr align -s hs -p rna-seq -OallowPartialAlignments=true data_R1.fastq.gz data_R2.fastq.gz alignments.vdjca
# 2. Assemble parial reads拼接部分reads，2 次迭代最优
> mixcr assemblePartial alignments.vdjca alignmentsRescued_1.vdjca
> mixcr assemblePartial alignmentsRescued_1.vdjca alignmentsRescued_2.vdjca
# 3. 利用已有 V 和 J 基因和 germline 覆盖度不全的 CDR3s 序列延长 TCR 比对结果
> mixcr extendAlignments alignmentsRescued_2.vdjca alignmentsRescued_2_extended.vdjca
# 4. Assemble拼接clones
> mixcr assemble alignmentsRescued_2_extended.vdjca clones.clns
# 5. Exporting导出clones
> mixcr exportClones -c TRA -o -t clones.clns clones.txt

1. 所有mixcr align的参数都可以在这里使用（比如 -s 来指定物种）： -OallowPartialAlignments=true选项保留部分比对结果用于后续的 assemblePartial 模块

2. 为了获得包含 CDR3 全长序列的拼接 reads，建议使用迭代 mixcr 的 assemblePartial模块多次迭代拼接结果。多次迭代需要 -p参数，根据我们的经验，两次迭代后结果最优

3. 注意 extend 时用的数据

4. 所有 mixcr assemble 的参数都可以在这里使用：

   1. 对于低质量数据，建议降低输入质量阈值（e.g. -ObadQualityThreshold=15）

   2. 用错误校正算法合并克隆丰度，可增加：OaddReadsCountOnClustering=true

5. 可以指定导出感兴趣的免疫受体链（-c TRA 或者 -c TRB等），也可以去除包含 out-of-frame （选项 -o）和 stop codon 的突变体（选项 -t）。

组装小鼠 TRB 样本的基于 CDR3 克隆类型

https://mixcr.readthedocs.io/en/master/quickstart.html#assembling-of-cdr3-based-clonotypes-for-mouse-trb-sample

参数解读

结果解读

输出文件包含内容：